含 10% 骨髓间充质干细胞条件培养液的 1640 完全培养基，培养 48 h后收集细胞，PBS 清洗 2 遍，均匀涂抹在载玻片上，40 g/L 多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗两三次，1% 结晶紫染色 30 min后 PBS 清洗两三次，晾干后镜检。

1.4.4 EdU 荧光染色检测增殖情况

取生长状态良好的RPMI8226 和 U266 细胞，以 1×104 个 / 孔接种于 6 孔板内，加入含体积分数为 1% 胎牛血清的 1640 培养基作用 12 h 使细胞同步化，然后对照组继续用 1640 完全培养基培养，实验组更换为含 10% 骨髓间充质干细胞条件培养液的 1640 完全培养基孵育 48 h，用 1640 完全培养基按 5 000 ∶ 1 的比例稀释 EdU 溶液，制备 50 μmol/L EdU 培养基标记 24 h，按说

明书配制 1X Apollo 和 Hoechst33342 染液并进行染色，荧光显微镜下观察拍照。

1.4.5 MTT 法检测增殖情况

取对数生长期的生长状态良好的 RPMI8226 和 U266 细胞，以 1×103 个 / 孔接种于 96 孔板内，加入含体积分数为 1% 胎牛血清的 1640 培养基作用 12 h 使细胞同步化，然后对照组继续用 1640 完全培养基培养，实验组更换为含 10% 骨髓间充质干细胞条件培养液的 1640 完全培养基，每组设置 6 个复孔，置培养箱内培养 6，12，48 h，小心吸去各孔内培养液，更换无血清培养基，每孔中加入MTT 溶液 20 μL，培养箱内孵育 4 h，然后加入 100 μL 的 20%SDS 溶液待其溶解，应用酶标检测仪于 570 nm 波长处检测各孔吸光度，并计算其细胞存活率。细胞存活率 (%) =( 实验组细胞吸光度值 / 对照组细胞吸光度值 )×100%。

1.4.6 流式细胞仪和荧光染色法检测细胞凋亡情况

取生长状态良好的 RPMI8226 和 U266 细胞，以 1×105个/瓶接种于 25 cm2 无菌培养瓶中，置 CO2 恒温箱中孵育 24 h，细胞同步化后，更换 1640 完全培养基和含 10% 骨髓间充质干细胞条件培养液的 1640 完全培养基孵育 48 h，2 000 r/min 离心5 min，按凯基生物细胞凋亡试剂盒说明书步骤染色，应用流式细胞仪和荧光倒置显微镜进行细胞凋亡分析。

1.4.7 Real-time PCR 检测 BCL-2、BTK 的 mRNA 表达

取生长状态良好的 U266 和 RPMI8226 细胞，以 2×106 个/瓶接种于 75 cm2 无菌培养瓶中，细胞同步化后，更换 1640 完全培养基和含 10% 骨髓间充质干细胞条件培养液的 1640 完全培养基孵育 48 h，收集细胞，采用 Trizol 法提取总 RNA，采用 Real-time PCR 进行基因片段扩增并定量。反应条件：①

Real-time PCR：95 ℃ 5 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 cycles； ② Melt curve：95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，60 cycles。引物序列如下，GAPDH 上游 5’-TGG ACC AAG TAC ATG AAC CAC C-3’；下游 5’- CTG GTG ATT GGA CAC GGT GA-3’；BCL-2 上游 5’- ACA CTG TTA AGC ATG TGC CG-3’；下游 5’-CCA GCT CAT CTC ACC TCA CA-3’；BTK 上游：5’-AGT ACG ACG TGG CCA TCA AG-3’；下游 5’-GCT

ATA CAT CAG GAC TCC GGT-3’。各管所加模板 RNA 的量约为 1 μL，最终通过 Real-time PCR 仪记录的 Ct 值相对定量。

1.4.8 Western blot 法检测 BCL-2、BTK 蛋白表达

取生长状态良好的 U266 和 RPMI8226 细胞，以 2×106 个 / 瓶接种于75 cm2 无菌培养瓶中，细胞同步化后，更换 1640 完全培养基和含 10% 骨髓间充质干细胞条件培养液的 1640 完全培养基孵育 48 h，收集细胞，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，全湿式电转法将分离胶上的蛋白转移到 PVDF 膜，将 PVDF 膜室温下封闭 2 h，4 ℃一抗孵育过夜，显影液于发光成像仪上成像,Image J 分析条带灰度值。

1.5 主要观察指标 RPMI8226 和 U266 细胞的增殖、存活率、 凋亡率以及 BCL-2、BTK 的 mRNA 和蛋白表达。

1.6 统计学分析 所有数据均为 3 次独立重复实验所得，数据采用 Graphpad Prism 8.3 软件分析，连续变量数据以 - x±s 表示，采用t检验进行组间比较，流式结果用Flowjo V10分析。 P < 0.05 为差异有显著性意义，并绘制统计图

2 结果

2.1 间充质干细胞表面标记物的流式鉴定结果  

间充质干细胞呈贴壁生长状态，并且高表达干细胞表面标志，如 CD90、CD105、CD73，而不表达 CD14、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR。

2.2 结晶紫染色观察细胞形态和数量

培养 48 h 后实验组RPMI8226 和 U266 细胞数量明显多于对照组，差异有显著性 意义 (P < 0.05)。

2.3 EdU 荧光染色检测细胞增殖情况 培养 48 h 后实验组RPMI8226 和 U266 细胞数量明显多于对照组，实验组 EdU 相对荧光强度百分率显著高于对照组，差异有显著性意义 (P < 0.05)。

2.4 MTT 检测细胞增殖情况

培养 6 h 时，对照组和实验组增殖速度相当；培养 12 h 时，实验组 RPMI8226 和 U266 细胞增殖速度开始加快；培养 48 h 时，实验组 RPMI8226 和U266 细胞增殖速度明显快于对照组 (P < 0.05)。

2.5 细胞凋亡率

对照组及实验组 RPMI8226 细胞总凋亡率分别为 (3.19±0.23)%，(1.24±0.03)%，对照组及实验组 U266细胞总凋亡率分别为 (2.63±0.19)%，(1.0