骨髓间充质干细胞条件培养液对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响

作者：黄 美、李艳菊

文题释义：

骨髓间充质干细胞条件培养液：骨髓间充质干细胞贴壁生长过程中会分泌各种生长因子、细胞因子等多种活性物质于培养液中，收集骨髓 间充质干细胞上清培养基，经过滤和超浓缩处理后，得到含有该间充质干细胞分泌物的培养液，称之为骨髓间充质干细胞条件培养液。

人骨髓间充质干细胞条件培养液成分和作用：骨髓间充质干细胞的旁分泌作用包括趋化性能、免疫调节功能、细胞生长支持功能、抗细胞凋亡及血管生成功能等，是通过其分泌的胰岛素样生长因子1、血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子等细胞因子实现的。

摘要

背景：近年来，骨髓微环境与多发性骨髓瘤细胞生长、存活及耐药性的关系成为科研人员研究热点，骨髓间充质干细胞条件培养液干预多发性骨髓瘤细胞株的实验鲜有报道。

目的：探讨骨髓间充质干细胞条件培养液对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响。

方法：经Ficoll密度梯度离心法及贴壁纯化健康供者骨髓来源间充质干细胞，收集第3-5代骨髓间充质干细胞的上清培养基，超滤离心管 制备浓缩骨髓间充质干细胞条件培养液，制备含10%人骨髓间充质干细胞条件培养液的1640完全培养基，诱导多发性骨髓瘤RPMI8226和 U266细胞株培养48 h，MTT法、EdU荧光染色检测细胞增殖能力；流式细胞仪和PI荧光染色检测细胞凋亡情况；Real-time PCR和Western blot检测细胞中BCL-2、BTK mRNA、蛋白表达水平。

结果与结论：骨髓间充质干细胞条件培养液能促进多发性骨髓瘤细胞株的增殖(P < 0.05)，抑制多发性骨髓瘤细胞的凋亡(P < 0.05)，与 BCL-2、BTK的mRNA和蛋白高表达密切相关(P < 0.05)。结果表明，骨髓间充质干细胞条件培养液可促进多发性骨髓瘤细胞增殖。

关键词：骨髓间充质干细胞；多发性骨髓瘤；条件培养液；增殖；凋亡

多发性骨髓瘤是位居血液系统第二的恶性肿瘤，其特征 在于骨髓中大量浆细胞恶性增生并产生单克隆免疫球蛋白或其片段 (M 蛋白 )。研究发现，多发性骨髓瘤细胞顽固的生长 优势，关键在于其不断改造以利于生存的肿瘤微环境，而骨髓微环境在多发性骨髓瘤细胞恶性克隆的选择、增殖中起着重要作用。研究表明，BCL-2 的过度表达参与多种血液系统 恶性肿瘤的发病机制，包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤等血液病。BTK 是一种非受体激酶，在多种恶性肿瘤的增殖和存活中起着至关重要的作用。研究显示，急性髓系白血病患者 BTK 异常增高，通过 BTK 抑制剂干预后，急性髓系白血病得到较好缓解。最新研究表明，骨髓间充质干细胞 (bonemarrow mesenchymal stem cell，BM-MSCs) 参与构建多发性骨髓瘤微环境，与多发性骨髓瘤细胞的生长、骨质破坏等关系密切。间充质干细胞是自我更新的多能祖细胞，具有分化为多种细胞功能，它们构成了骨髓基质的主要细胞区室。有研究证明，间充质干细胞分泌高水平的细胞因子为肿瘤细胞提供了支持的微环境。目前，间充质干细胞与多发性骨髓瘤细胞建立的共培养体系已成熟，但骨髓间充质干细胞条件培养液与多发性骨髓瘤之间的交互作用未见相关报道。该研究旨在探讨间骨髓充质干细胞条件培养液对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响，以及 BCL-2 和 BTK 的表达，其结果将有助于阐明骨髓间充质干细胞与多发性骨髓瘤之间的作用关系。

1 材料和方法

1.1 设计 体外细胞学实验，采用 t 检验进行组间比较。

1.2 时间及地点 实验于 2019 年 10 月至 2020 年 12 月在贵州医科大学干细胞重点实验室完成。

1.3 材料 骨髓血由贵州医科大学附属医院血液科提供。选取健康体检者 8 例，均经过知情同意后获取骨髓血标本，该研究获得贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准。多发性骨髓瘤 RPMI8226 和 U266 细胞由贵州医科大学附属医院

血液科王季石教授实验室赠予。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞培养和分组

 Ficoll 密度梯度离心法及贴壁纯化人骨髓来源间充质干细胞，取第 3-5 代细胞进行实验，流式细胞仪鉴定其免疫表型，收集间充质干细胞上清培养液，在 4 ℃下 1 000 r/min 离心 5 min，分离出间充质干细胞条件培养液，过滤后将上清液保存在 -20 ℃，骨髓间充质干细胞条件培养液在截留分子质量为 5 kD 的超滤离心管中浓缩 50 倍。

1.4.2 流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物

取第 3 代骨髓间充质干细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞数约2×105 个，分别加入鼠抗人 CD105-PE、CD90-PE、CD45-PE、CD34-FITC、CD14-FITC、CD73-PE、CD11b-PE、HLA-DR-FITC 单克隆抗体，同型对照抗体 (IgG) 作为阴性对照，室温避光染色 20 min，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。

1.4.3 结晶紫染色观察细胞形态

取状态良好的 RPMI8226 和U266 细胞以 1×104 个 / 孔接种于 6 孔板内，加入含体积分数为 1% 胎牛血清的 1640 培养基作用 12 h 使细胞同步化，对照组继续用 1640 完全培养基培养，实验组更换为